HVEM CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433022-ACT

Tnfrsf14 kodiert HVEM (Herpesvirus-Entry-Mediator), ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Superfamilie, das als immunregulatorischer Knotenpunkt die Aktivierung, das Überleben und Zytokinprogramme von Lymphozyten steuert. HVEM integriert Signale über Interaktionen mit BTLA, CD160, LIGHT (TNFSF14) und verwandten Liganden und beeinflusst dadurch kostimulatorische versus coinhibitorische Effekte; dabei werden NF-κB und weitere nachgeschaltete transkriptionelle Signalwege moduliert. In Mausmodellen wirkt sich eine veränderte HVEM-Signalgebung auf die Homöostase von T- und B-Zellen, Keimzentrumsreaktionen und das mukosale Immungleichgewicht aus. Eine Fehlregulation dieser Achse wird häufig im Zusammenhang mit Entzündung, Autoimmunität und Mechanismen der Tumor-Immunevasion untersucht.

HVEM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tnfrsf14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HVEM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tnfrsf14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tnfrsf14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HVEM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tnfrsf14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HVEM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HVEM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tnfrsf14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.