Plasmide CRISPR d'Activation (h) HURP: sc-402206-ACT

DLGAP5 code pour HURP, une protéine associée aux microtubules qui s’accumule sur les fibres du kinétochore et stabilise les microtubules du fuseau afin de favoriser la congrégation des chromosomes et leur ségrégation fidèle pendant la mitose. HURP est régulée par des kinases du cycle cellulaire ainsi que par la voie Ran-GTP/importine, intégrant des signaux qui coordonnent l’assemblage du fuseau avec la progression à travers la transition G2/M. Par ses rôles dans la dynamique du fuseau et l’intégrité du point de contrôle mitotique, une expression dérégulée de HURP est associée à des phénotypes prolifératifs et à l’instabilité génomique observés dans de nombreux contextes cancéreux. Dans des modèles de cellules humaines, DLGAP5/HURP est fréquemment étudiée comme un marqueur du contrôle mitotique, de la tolérance à l’aneuploïdie et des réponses au stress induit par des agents ciblant les microtubules.

HURP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DLGAP5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HURP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DLGAP5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DLGAP5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HURP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DLGAP5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HURP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HURP dans les cellules tumorales présentant une expression de DLGAP5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.