Plasmide CRISPR d'Activation (h) Hugl-1: sc-403441-ACT

LLGL1 code la protéine humaine Hugl-1, un régulateur conservé de la polarité des cellules épithéliales et de l’organisation de la membrane basolatérale. Hugl-1 agit au sein des réseaux de polarité apico-basale qui coordonnent l’intégrité des jonctions, la division cellulaire asymétrique et l’organisation du cytosquelette, influençant ainsi l’architecture tissulaire et la différenciation. La perturbation du contrôle de la polarité est associée à une migration altérée et à un comportement invasif, ce qui fait de LLGL1 un nœud pertinent pour les études de l’homéostasie épithéliale, de la morphogenèse et de la perte de polarité associée aux tumeurs. L’expression et la localisation de LLGL1 sont également utilisées pour analyser les interactions (cross-talk) entre les modules de polarité et les voies qui régissent la prolifération et l’adhérence cellule–cellule.

Hugl-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LLGL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Hugl-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LLGL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LLGL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Hugl-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LLGL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Hugl-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Hugl-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de LLGL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.