Plasmide CRISPR d'Activation (h) HSPC171: sc-412030-ACT

TMEM208 code pour la protéine membranaire humaine HSPC171, un facteur associé au réticulum endoplasmique (RE) impliqué dans le maintien de l’homéostasie du RE et dans la coordination des réponses adaptatives au stress protéostatique et métabolique. En influençant l’organisation du RE et les sorties de signalisation liées aux voies de la réponse aux protéines mal repliées (UPR), TMEM208 peut affecter des processus en aval tels que le contrôle qualité des protéines, la gestion des lipides et les programmes transcriptionnels induits par le stress. Des altérations de la signalisation du stress du RE et des déséquilibres de la protéostasie sont des caractéristiques récurrentes des cancers, des maladies neurodégénératives et des troubles métaboliques, ce qui fait de TMEM208/HSPC171 une cible pertinente pour des études mécanistiques reliant la fonction du RE à la survie cellulaire, à la différenciation et à la signalisation inflammatoire. En tant que composant transmembranaire aux rôles potentiellement régulateurs, TMEM208 présente également un intérêt pour cartographier les réseaux résidents des organites et identifier des dépendances spécifiques au contexte selon les types cellulaires.

HSPC171 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMEM208 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HSPC171 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMEM208 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMEM208, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HSPC171. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMEM208 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HSPC171 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HSPC171 dans les cellules tumorales présentant une expression de TMEM208 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.