Plásmido CRISPR de Activación (m) HSPA5/BiP/GRP78: sc-420699-ACT

El gen Hspa5 de ratón codifica HSPA5 (BiP/GRP78), una chaperona de la familia HSP70 del retículo endoplásmico (RE) que se une a polipéptidos nacientes, favorece el plegamiento y el ensamblaje de proteínas, y regula la homeostasis de Ca²⁺ en el RE. HSPA5 es un sensor y efector central de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), coordinando la señalización del estrés del RE a través de PERK–EIF2α, IRE1–XBP1 y ATF6 para restaurar la proteostasis o activar la apoptosis bajo estrés persistente. Mediante sus funciones en la degradación asociada al RE (ERAD), la maduración de la vía secretora y el control de calidad, HSPA5 influye en el metabolismo celular, el equilibrio redox y la señalización inflamatoria. La actividad desregulada de HSPA5/UPR se estudia ampliamente en contextos como la neurodegeneración, el estrés metabólico y la biología tumoral, donde las alteraciones de la proteostasis y la adaptación al estrés del RE moldean la supervivencia celular y las interacciones inmunitarias.

HSPA5/BiP/GRP78 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Hspa5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HSPA5/BiP/GRP78 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Hspa5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Hspa5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HSPA5/BiP/GRP78. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Hspa5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HSPA5/BiP/GRP78 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HSPA5/BiP/GRP78 en células tumorales con expresión de Hspa5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.