HSP 90 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400605-ACT

HSP90B1 kodiert GRP94, ein Chaperon der HSP90-Familie im endoplasmatischen Retikulum, das die Faltung, Reifung und Qualitätskontrolle sekretierter und membranständiger Proteine unterstützt, darunter Integrine und Toll-like-Rezeptoren. Es wirkt im Rahmen der Unfolded-Protein-Response sowie der ER-assoziierten Degradationswege (ERAD), um während zellulären Stresses die Proteostase aufrechtzuerhalten. Durch die Regulation von Stabilität und intrazellulärem Transport seiner Client-Proteine beeinflusst GRP94 die Immun-Signalübertragung, Zelladhäsion und die Biologie von Wachstumsfaktor-Rezeptoren. Eine Fehlregulation der HSP90B1-Aktivität und von ER-Stressantworten wurde mit Tumorprogression, entzündlichen Phänotypen und einem mit Neurodegeneration verbundenen Ungleichgewicht der Proteostase in Verbindung gebracht, was es zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Analyse von Signalwegen in menschlichen Zellmodellen macht.

GRP 94 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSP90B1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GRP 94 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSP90B1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSP90B1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GRP 94-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSP90B1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GRP 94-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GRP 94-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSP90B1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.