Plasmide CRISPR d'Activation (h) HRT2: sc-404761-ACT

Le gène humain HEY2 (HRT2) code un répresseur transcriptionnel de type hélice–boucle–hélice basique, qui agit comme un effecteur canonique en aval de la signalisation Notch. En s’associant à des complexes transcriptionnels dépendants de RBPJ/CSL, HRT2 contribue à réguler les décisions de destinée cellulaire, la temporalité de la différenciation et l’organisation des tissus, avec des rôles marqués dans les programmes cardiovasculaires et de neurodéveloppement. HEY2 module des réseaux transcriptionnels qui gouvernent la maturation des cellules musculaires lisses et des cardiomyocytes, la spécification ventriculaire et les transitions épithélio-mésenchymateuses. Une expression dérégulée de HEY2 ou une activité anormale de la voie a été associée à des phénotypes de cardiopathies congénitales, à des traits liés aux arythmies, ainsi qu’à des états de différenciation altérés observés dans le cancer et certains troubles du développement.

HRT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HEY2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HRT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HEY2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HEY2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HRT2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HEY2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HRT2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HRT2 dans les cellules tumorales présentant une expression de HEY2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.