HPRG Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404772-ACT

La glicoproteina ricca di istidina (HPRG), codificata dal gene umano HRG, è una proteina plasmatica secreta che si lega a eparina, plasminogeno, fibrina/fibrinogeno e ioni metallici bivalenti, modulando le interazioni con la matrice extracellulare e l’equilibrio proteolitico. Attraverso queste interazioni, HPRG influenza la dinamica della coagulazione e della fibrinolisi, la segnalazione angiogenica e i processi dell’immunità innata, inclusi il comportamento dei neutrofili e la rimozione dei detriti cellulari. L’espressione di HRG e i livelli circolanti di HPRG sono stati studiati come variabili associate a stati infiammatori e alla biologia vascolare, con implicazioni per l’interpretazione di fenotipi legati all’emostasi e all’immunità. In quanto proteina multifunzionale di legame a ligandi, HPRG è spesso analizzata in vie che collegano tromboinfiammazione, rimodellamento della matrice e segnalazione dei glicosaminoglicani di superficie cellulare.

HPRG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HRG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HPRG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HRG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HRG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HPRG. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HRG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HPRG nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HPRG nelle cellule tumorali con espressione di HRG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.