Plásmido CRISPR de Activación (h) HMGCR: sc-400560-ACT

HMGCR codifica la 3‑hidroxi‑3‑metilglutaril‑CoA reductasa, una enzima de membrana del retículo endoplásmico (RE) que cataliza la conversión limitante de la velocidad de HMG‑CoA a mevalonato en la vía de biosíntesis del colesterol. Al controlar el flujo de mevalonato, HMGCR influye en la producción posterior de esteroles e isoprenoides que sustenta la biogénesis de membranas, la prenilación de proteínas y una homeostasis metabólica más amplia. Su actividad está estrechamente regulada por la transcripción dependiente de SREBP, la retroalimentación por detección de esteroles y la degradación asociada al RE, vinculando el estado nutricional con la síntesis de lípidos. La expresión desregulada de HMGCR o la actividad de la vía se estudian con frecuencia en la hipercolesterolemia, en mecanismos relacionados con la aterosclerosis, en el síndrome metabólico y en estados proliferativos donde la dependencia de la vía del mevalonato puede moldear los fenotipos celulares.

HMGCR El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HMGCR sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HMGCR El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HMGCR en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HMGCR, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HMGCR. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HMGCR y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HMGCR en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HMGCR en células tumorales con expresión de HMGCR silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.