Plásmido CRISPR de Activación (m) hippocalcin: sc-420938-ACT

Hpca codifica la hipocalcina, una proteína de unión al calcio con motivo EF-hand enriquecida en neuronas que funciona como sensor de calcio, conectando los transitorios de Ca2+ dependientes de la actividad con la señalización aguas abajo. La hipocalcina participa en mecanismos de plasticidad sináptica al modular interacciones proteicas reguladas por Ca2+, la asociación a membrana mediante el cambio por miristoilación (myristoyl switching) y procesos relacionados con la endocitosis que modelan la neurotransmisión. En circuitos cerebrales de ratón, la expresión de Hpca se asocia con la regulación de la excitabilidad neuronal y cambios sinápticos a largo plazo, vinculándola con vías que influyen en el aprendizaje y la memoria. La alteración de la homeostasis del calcio y de la señalización sináptica implica a redes relacionadas con la hipocalcina en la neurodegeneración y en fenotipos relevantes para enfermedades neuropsiquiátricas utilizados en modelos de investigación mecanística.

hippocalcin El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Hpca sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

hippocalcin El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Hpca en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Hpca, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de hippocalcin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Hpca y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de hippocalcin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía hippocalcin en células tumorales con expresión de Hpca silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.