Hepsin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405081-ACT

L’HPN umano codifica per hepsina, una proteasi serinica transmembrana di tipo II localizzata sulla superficie cellulare, dove regola la proteolisi pericellulare e il rimodellamento della matrice extracellulare. Hepsina partecipa alla segnalazione mediata da proteasi scindendo substrati in grado di modulare la disponibilità dei fattori di crescita, l’adesione cellulare e il comportamento invasivo, collegandola a vie che governano l’organizzazione epiteliale e l’omeostasi tissutale. Una deregolazione dell’espressione di HPN è stata associata ad alterazioni della differenziazione epiteliale e a programmi proteolitici associati al tumore, rendendola rilevante per lo studio dei meccanismi di migrazione cellulare, dell’integrità della barriera e del crosstalk con il microambiente. In quanto proteasi ancorata alla membrana, hepsina è inoltre utile per indagare le reti proteasiche e le risposte trascrizionali a valle innescate dalla proteolisi di superficie.

Hepsin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HPN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Hepsin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HPN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HPN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Hepsin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HPN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Hepsin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Hepsin nelle cellule tumorali con espressione di HPN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.