Hepsin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405081-ACT

Das humane Gen **HPN** kodiert **Hepsin**, eine **Typ-II-transmembrane Serinprotease**, die an der Zelloberfläche lokalisiert ist und dort die **perizelluläre Proteolyse** sowie den **Umbau der extrazellulären Matrix** reguliert. Hepsin ist an proteasegetriebener Signalübertragung beteiligt, indem es Substrate spaltet, die die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren, die Zelladhäsion und invasives Verhalten modulieren können, und ist damit mit Signalwegen verknüpft, die die epitheliale Organisation und die Gewebehomöostase steuern. Eine fehlregulierte **HPN**-Expression wurde mit veränderter epithelialer Differenzierung und tumorassoziierten proteolytischen Programmen in Verbindung gebracht, was sie für die Untersuchung von Mechanismen der Zellmigration, der Barriereintegrität und der Kommunikation mit der Mikroumgebung relevant macht. Als membranverankerte Protease ist Hepsin zudem hilfreich zur Untersuchung von Protease-Netzwerken und nachgeschalteten transkriptionellen Antworten, die durch Oberflächenproteolyse ausgelöst werden.

Hepsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HPN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Hepsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HPN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HPN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Hepsin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HPN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Hepsin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Hepsin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HPN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.