Plásmido CRISPR de Activación (h) Hemoglobin ε: sc-403392-ACT

HBE1 codifica la cadena épsilon de la hemoglobina embrionaria, una subunidad de globina que se empareja con cadenas de tipo alfa para formar hemoglobina funcional durante las primeras etapas del desarrollo humano. La hemoglobina ε contribuye al transporte de oxígeno y al equilibrio redox en las células eritroides, lo que vincula su expresión con la biosíntesis del hemo, el manejo del hierro y los programas de diferenciación eritroide regulados por la región de control del locus de las globinas. El cambio del desarrollo desde la expresión de globinas embrionarias a fetales y adultas es un proceso transcripcional estrictamente regulado que implica remodelación de la cromatina y factores de transcripción específicos de linaje. La desregulación de la regulación de los genes de globina y del ensamblaje de la hemoglobina es relevante para las hemoglobinopatías y para estudios más amplios de la eritropoyesis, el estrés oxidativo y la biología sensible a la hipoxia.

Hemoglobin ε El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HBE1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Hemoglobin ε El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HBE1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HBE1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Hemoglobin ε. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HBE1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Hemoglobin ε en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Hemoglobin ε en células tumorales con expresión de HBE1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.