HECTD1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-431500-LAC

Il gene murino Hectd1 codifica HECTD1, una ligasi E3 dell’ubiquitina con dominio HECT che catalizza il trasferimento di ubiquitina su proteine bersaglio per regolarne la stabilità, la localizzazione e l’output di segnalazione. HECTD1 è stata collegata al controllo dell’organizzazione del citoscheletro e della polarità cellulare, influenzando processi quali la migrazione cellulare, la morfogenesi epiteliale e la patterning dei tessuti durante lo sviluppo. Attraverso la modulazione ubiquitina-dipendente dei componenti delle vie di segnalazione, HECTD1 viene studiata nel contesto delle reti di proteostasi e delle cascate di segnalazione che governano differenziamento e risposte allo stress. La disregolazione dell’attività delle ligasi E3 e della segnalazione dell’ubiquitina è ampiamente rilevante per difetti congeniti e fenotipi neuroevolutivi e oncogenici, rendendo Hectd1 un nodo utile per ricerche meccanicistiche nei sistemi murini.

Le particelle di attivazione lentivirale HECTD1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Hectd1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale HECTD1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Hectd1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di HECTD1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Hectd1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.