Plásmido CRISPR de Activación (h) HCN4: sc-402293-ACT

HCN4 codifica el canal 4 activado por hiperpolarización y regulado por nucleótidos cíclicos (HCN4), un mediador principal de la corriente “funny” (If), que contribuye a la despolarización diastólica espontánea y a la actividad eléctrica rítmica. El canal conduce corrientes de entrada mixtas de Na⁺/K⁺ activadas por la hiperpolarización y está modulado directamente por el AMPc, vinculando la señalización autonómica con la excitabilidad de la membrana. HCN4 actúa en la intersección entre la regulación del marcapasos, la dinámica de repolarización de la membrana y las vías de señalización dependientes de AMPc que determinan el disparo de potenciales de acción. Las alteraciones en la expresión o función de HCN4 se han asociado con fenotipos de conducción cardíaca y con la regulación del ritmo, lo que la hace relevante para estudios mecanísticos de electrofisiología y excitabilidad en modelos celulares humanos.

HCN4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HCN4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HCN4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HCN4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HCN4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HCN4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HCN4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HCN4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HCN4 en células tumorales con expresión de HCN4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.