G_{α t1} CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401559-ACT

GNAT1 kodiert die alpha‑Untereinheit Gαt1 (Transducin‑Alpha) eines heterotrimeren G‑Proteins, einen zentralen Signalüberträger in Stäbchen‑Photorezeptoren, der aktiviertes Rhodopsin mit Effektorenzymen der Phototransduktionskaskade koppelt. Nach Lichtstimulation fördert Gαt1 die Aktivierung der Phosphodiesterase, wodurch die cGMP‑Spiegel sinken; dies moduliert die Aktivität zyklisch‑nukleotid‑gesteuerter Kanäle und steuert die Hyperpolarisation der Membran. Dieser Signalweg verknüpft GPCR‑Signalgebung mit der Regulation von Second Messengern und unterstützt so visuelle Empfindlichkeit und Adaptation bei schwachem Licht. Eine Fehlregulation oder veränderte Expression von Komponenten der Phototransduktion, einschließlich GNAT1, ist relevant für Untersuchungen zu erblichen Netzhautfunktionsstörungen und zu Mechanismen, die die Homöostase der Stäbchensignalübertragung stören.

Gα t1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GNAT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Gα t1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GNAT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GNAT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Gα t1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GNAT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Gα t1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Gα t1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GNAT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.