Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α i-2}: sc-400568-ACT

GNAI2 code pour la sous-unité alpha Gαi-2 de la protéine G hétérotrimérique humaine, une GTPase qui couple de nombreux GPCR à l’inhibition de l’adénylate cyclase et à la diminution de l’AMPc intracellulaire. Via la signalisation GPCR–Gi, Gαi-2 influence l’activité des voies MAPK et PI3K-AKT, régule la fonction des canaux ioniques et module la chimiotaxie, la sécrétion et la dynamique du cytosquelette dans divers types cellulaires. Des altérations de la signalisation de GNAI2 ont été étudiées dans le trafic des cellules immunitaires et les réponses inflammatoires, ainsi que dans des processus oncogéniques où la prolifération et la migration induites par les GPCR sont dérégulées. Sa position centrale dans le contrôle des seconds messagers en fait un nœud utile pour disséquer la signalisation proximale aux récepteurs et le remodelage des voies dépendant du contexte.

Gα i-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNAI2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα i-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNAI2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNAI2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα i-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNAI2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα i-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα i-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNAI2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.