Plasmide CRISPR d'Activation (h) GSK-3α: sc-400518-ACT

GSK3A code la glycogène synthase kinase-3 alpha (GSK-3α), une sérine/thréonine kinase qui intègre de multiples signaux pour réguler, via des mécanismes dépendants de la phosphorylation, le métabolisme, la prolifération et la différenciation. GSK-3α intervient dans la signalisation canonique Wnt/β-caténine en contrôlant le renouvellement (turnover) de la β-caténine, et interagit également avec la voie insuline/PI3K–AKT, dans laquelle la phosphorylation inhibitrice par AKT module son activité. Par ces voies, GSK-3α influence la synthèse du glycogène, la progression du cycle cellulaire et des programmes transcriptionnels liés à la mise en place du plan de développement et aux réponses cellulaires au stress. Une activité dérégulée de GSK3A et de la signalisation en aval a été associée à des mécanismes pertinents pour la biologie des cancers, la neurodégénérescence et des modèles de maladies métaboliques.

GSK-3α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GSK3A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GSK-3α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GSK3A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GSK3A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GSK-3α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GSK3A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GSK-3α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GSK-3α dans les cellules tumorales présentant une expression de GSK3A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.