GPRC6A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403492-ACT

GPRC6A kodiert einen G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor der Klasse C, der an der Nährstoffwahrnehmung und am endokrinen‑metabolischen Crosstalk beteiligt ist und auf extrazelluläre Signale wie basische Aminosäuren und zweiwertige Kationen reagiert. Durch die Kopplung an heterotrimere G‑Proteine kann GPRC6A die Second‑Messenger‑Signalübertragung sowie nachgeschaltete Kinasewege modulieren, die den Zellstoffwechsel, die Hormonausschüttung und den Entzündungsstatus beeinflussen. Seine Aktivität wurde unter anderem im Zusammenhang mit der Glukosehomöostase, der Energiebilanz und osteoendokriner Signalgebung untersucht und verknüpft damit rezeptorabhängige Signalwege mit metabolischer und Skelettbiologie. Eine veränderte GPRC6A‑Expression oder ‑Signalgebung wurde in der Literatur mit komplexen Krankheitsphänotypen in Verbindung gebracht, die für Adipositas, Typ‑2‑Diabetes und kardiometabolische Merkmale relevant sind, was seinen Einsatz in mechanistischen Signalwegstudien unterstützt.

GPRC6A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPRC6A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPRC6A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPRC6A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPRC6A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPRC6A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPRC6A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPRC6A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPRC6A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPRC6A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.