Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPR4: sc-403659-ACT

Le GPR4 humain code un récepteur couplé aux protéines G sensible aux protons, qui agit comme capteur du pH extracellulaire en reliant des microenvironnements acides à la signalisation intracellulaire. Lors de son activation, GPR4 s’associe à des protéines G hétérotrimériques afin de moduler des voies de seconds messagers, notamment l’axe AMPc/PKA et des programmes cytosquelettiques et transcriptionnels dépendants de RhoA, influençant le comportement des cellules endothéliales et immunitaires. Ce récepteur contribue à la régulation de l’homéostasie vasculaire, de la fonction de barrière et de la signalisation inflammatoire dans des contextes où survient une acidose tissulaire. Une activité altérée de GPR4 a été associée à des processus pertinents pour la pathologie, tels que l’inflammation vasculaire et les réponses au stress du microenvironnement dans des modèles de cancer et de maladies cardiométaboliques, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques.

GPR4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GPR4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPR4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GPR4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GPR4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPR4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GPR4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPR4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPR4 dans les cellules tumorales présentant une expression de GPR4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.