Plásmido CRISPR de Activación (h) GPR116: sc-408424-ACT

ADGRF5 (GPR116) es un receptor de adhesión acoplado a proteínas G (GPCR) con un gran extremo N extracelular y un sitio de proteólisis característico de los GPCR, que conecta las interacciones con la matriz extracelular y entre células con la señalización intracelular. Se expresa en compartimentos epiteliales y endoteliales, incluido el pulmón, donde contribuye a la homeostasis tisular y a procesos relacionados con la barrera mediante vías mediadas por GPCR, como las de cAMP/PKA y las GTPasas Rho. GPR116 se ha implicado en la regulación del equilibrio del surfactante y de la función alveolar, y su expresión alterada se ha asociado con remodelado inflamatorio y respuestas fibróticas en tejidos respiratorios. También se ha descrito la desregulación de ADGRF5 en múltiples conjuntos de datos transcriptómicos de cáncer, lo que respalda su uso en estudios de interacciones tumor–microambiente, señalización de adhesión y migración celular.

GPR116 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ADGRF5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GPR116 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ADGRF5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ADGRF5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GPR116. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ADGRF5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GPR116 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GPR116 en células tumorales con expresión de ADGRF5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.