Plasmide CRISPR d'Activation (h) gp91phox/CYBB/NOX2: sc-400222-ACT

CYBB code gp91phox (NOX2), la sous-unité membranaire catalytique du complexe NADPH oxydase (NOX2) des phagocytes, qui transfère des électrons du NADPH vers l’oxygène moléculaire afin de générer le superoxyde et, en aval, des espèces réactives de l’oxygène. Cette poussée oxydative soutient la défense immunitaire innée, la fonction phagolysosomale, la signalisation sensible au statut rédox et des réponses inflammatoires régulées dans les neutrophiles, les macrophages et d’autres lignées myéloïdes. L’activité de NOX2 s’intègre aux voies qui contrôlent la destruction des microbes, la production de cytokines et la formation de NETs, et contribue plus largement à l’homéostasie rédox des cellules immunitaires. La dérégulation ou la perte de fonction de CYBB est associée à une production de ROS diminuée et à des phénotypes d’immunodéficience, et les ROS dépendantes de NOX2 ont également été étudiées dans des contextes d’inflammation chronique et de lésions tissulaires.

gp91phox/CYBB/NOX2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CYBB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

gp91phox/CYBB/NOX2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CYBB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CYBB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de gp91phox/CYBB/NOX2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CYBB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de gp91phox/CYBB/NOX2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie gp91phox/CYBB/NOX2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CYBB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.