GnRH I Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401425-ACT

GNRH1 codifica l’ormone di rilascio delle gonadotropine I (GnRH I), un decapeptide ipotalamico che avvia la segnalazione endocrina riproduttiva stimolando le cellule gonadotrope dell’adenoipofisi a secernere l’ormone luteinizzante e l’ormone follicolo-stimolante. Il GnRH I viene prodotto a partire da un preproormone ed elaborato attraverso vie secretorie regolamentate; il suo rilascio pulsatile coordina la funzione dell’asse ipotalamo–ipofisi–gonadi, la maturazione sessuale e la fertilità. L’attivazione del recettore del GnRH coinvolge la segnalazione della fosfolipasi C mediata da Gq/11, con attivazione a valle di IP3/DAG, mobilizzazione del calcio e vie delle protein chinasi che controllano la trascrizione dei geni delle gonadotropine e le dinamiche di secrezione. Una segnalazione di GnRH I disregolata è implicata in disturbi della tempistica puberale e in stati ipogonadotropi, ed è frequentemente studiata nella regolazione neuroendocrina, nella biologia della riproduzione e in modelli di patologie ormono-dipendenti.

GnRH I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNRH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GnRH I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNRH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNRH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GnRH I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNRH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GnRH I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GnRH I nelle cellule tumorali con espressione di GNRH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.