Plasmide CRISPR d'Activation (h) GMPPB: sc-408461-ACT

GMPPB (GDP-mannose pyrophosphorylase B) code une enzyme qui produit le GDP-mannose, un substrat donneur central pour les réactions de glycosylation nécessaires au bon repliement des protéines, à leur trafic intracellulaire et aux interactions avec la matrice extracellulaire. Dans les cellules humaines, GMPPB soutient les voies de glycosylation N-liée et d’O-mannosylation, particulièrement importantes pour la glycosylation de l’α-dystroglycane et d’autres glycoprotéines associées à la membrane. Une diminution de la disponibilité du GDP-mannose peut altérer le traitement ER–Golgi, compromettre l’adhérence cellule–matrice et perturber des réseaux de signalisation dépendants de la maturation des glycoprotéines. Des variants affectant la fonction de GMPPB sont associés à des phénotypes neuromusculaires du spectre des dystroglycanopathies, ce qui rend ce gène pertinent pour l’étude des mécanismes dépendants de la glycosylation en biologie du muscle et du système nerveux.

GMPPB Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GMPPB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GMPPB Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GMPPB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GMPPB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GMPPB. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GMPPB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GMPPB au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GMPPB dans les cellules tumorales présentant une expression de GMPPB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.