GlyRS CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404105-ACT

GARSはヒトのグリシルtRNA合成酵素（GlyRS）をコードしており、細胞質に存在するアミノアシルtRNA合成酵素として、翻訳の正確性を担保するためにグリシンを対応するtRNAに結合（アミノアシル化）させます。GlyRSはtRNAのチャージングという必須機能を通じて、全般的なタンパク質合成、プロテオスタシス（タンパク質恒常性）、および翻訳需要に連動した細胞ストレス応答を支えています。tRNA合成酵素活性の攪乱は神経筋および末梢神経の表現型と関連することから、GARSは翻訳制御とニューロン維持を結び付ける機構を研究する上で有用な結節点となります。またGARSの発現と機能は、タンパク質恒常性におけるミトコンドリア—細胞質間の協調や、代謝ストレス／プロテオトキシックストレスに対する細胞適応とも関係しています。

GlyRS CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性GARSの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GlyRS CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における GARS 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はGARS転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GlyRSの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のGARS遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGlyRS依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびGARS発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGlyRS経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。