Plásmido CRISPR de Activación (m) glypican-4: sc-420640-ACT

El gen Gpc4 de ratón codifica la glicano-4, un proteoglucano de heparán sulfato anclado a glicosilfosfatidilinositol (GPI) que se localiza en la superficie celular y en la matriz extracelular, donde modula la disponibilidad de ligandos y la interacción con los receptores. La glicano-4 moldea los gradientes de morfógenos y factores de crecimiento y puede influir en vías de señalización como Wnt/β-catenina, Hedgehog, FGF y BMP mediante interacciones dependientes del heparán sulfato. A través de estas funciones, Gpc4 contribuye al patrón de desarrollo, la remodelación tisular y las decisiones de destino celular, y la señalización alterada mediada por glicanos se ha asociado con una proliferación y diferenciación desreguladas en contextos relevantes para enfermedad. En modelos murinos, Gpc4 también se estudia en relación con fenotipos metabólicos e inflamatorios, incluida la biología del tejido adiposo y redes de señalización sensibles a la insulina.

glypican-4 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Gpc4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

glypican-4 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Gpc4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Gpc4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de glypican-4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Gpc4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de glypican-4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía glypican-4 en células tumorales con expresión de Gpc4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.