Plasmide CRISPR d'Activation (h) GILT: sc-404810-ACT

La protéine 30 induite par l’interféron gamma (IFI30), également appelée réductase thiol lysosomale induite par l’interféron gamma (GILT), est une enzyme lysosomale qui catalyse la réduction des ponts disulfure afin de faciliter le traitement des antigènes internalisés en vue de leur présentation par le CMH de classe II. En favorisant la génération de peptides dans le compartiment endo-lysosomal, IFI30 soutient l’activation de l’immunité adaptative et s’articule avec des programmes de signalisation innée pilotés par l’interféron. L’activité d’IFI30 contribue à la protéostasie dépendante du rédox lors de la prise en charge des antigènes et peut influencer la communication entre cellules immunitaires au sein de microenvironnements inflammatoires. Un traitement antigénique dérégulé et des états transcriptionnels associés à l’interféron impliquant IFI30 sont fréquemment étudiés dans des contextes d’inflammation chronique, de biologie des infections et d’immunologie tumorale.

GILT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de IFI30 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GILT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus IFI30 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription IFI30, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GILT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus IFI30 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GILT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GILT dans les cellules tumorales présentant une expression de IFI30 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.