GFRα-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405061-ACT

GFRA3 kodiert den humanen, über einen Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-Anker membrangebundene Rezeptor GFRα-3. Dieser fungiert als Korezeptor, der Mitglieder der Ligandenfamilie des glial cell line–derived neurotrophic factor (GDNF) bindet und die Signalübertragung an die RET-Rezeptor-Tyrosinkinase koppelt. Über die RET-abhängige Aktivierung von MAPK/ERK, PI3K/AKT und verwandten Überlebens- und Differenzierungswegen trägt GFRα-3 zur neuronalen Entwicklung, zur Axonführung sowie zur Aufrechterhaltung peripherer sensorischer und autonomer Neurone bei. Die Expression und Signalgebung von GFRA3 wurden u. a. im Kontext der neuroentwicklungsbezogenen Regulation, der schmerzrelevanten Biologie sensorischer Neurone sowie der Modulation onkogener Signalwege in ausgewählten Tumormodellen untersucht, in denen eine Aktivität der RET-Achse eine Rolle spielt. Als Bestandteil eines Zelloberflächenrezeptors ist es zudem nützlich zur Untersuchung der Ligand–Rezeptor-Spezifität, des Aufbaus von Rezeptorkomplexen und nachgeschalteter transkriptioneller Antworten.

GFRα-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GFRA3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GFRα-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GFRA3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GFRA3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GFRα-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GFRA3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GFRα-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GFRα-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GFRA3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.