Plasmide CRISPR d'Activation (h) GDF-8: sc-400693-ACT

Le gène humain MSTN code le facteur de croissance/différenciation 8 (GDF-8, myostatine), un ligand sécrété de la superfamille TGF-β qui agit comme un puissant régulateur négatif de la croissance du muscle squelettique. GDF-8 signale principalement via les récepteurs de type II de l’activine et, en aval, par la phosphorylation de SMAD2/3, afin de limiter la prolifération et la différenciation des myoblastes, tout en influençant le renouvellement des protéines et les programmes d’expression de gènes métaboliques. Cet axe interfère avec des voies qui contrôlent la myogenèse, le remodelage de la matrice extracellulaire et la signalisation inflammatoire dans le muscle. Une activité dérégulée de MSTN/GDF-8 a été associée à des phénotypes de masse musculaire altérés et est fréquemment étudiée dans le contexte de la fonte musculaire, de la sarcopénie et de la biologie des maladies neuromusculaires.

GDF-8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MSTN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GDF-8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MSTN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MSTN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GDF-8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MSTN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GDF-8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GDF-8 dans les cellules tumorales présentant une expression de MSTN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.