GCSH CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-406784-ACT-2

Das humane GCSH-Gen kodiert das H-Protein des Glycinspaltungssystems, eine mitochondriale Lipoyl-Trägeruntereinheit, die Zwischenprodukte zwischen den P-, T- und L-Komponenten des Glycin-Decarboxylase-Komplexes transportiert und damit den Glycinabbau sowie die Übertragung von Ein-Kohlenstoff-Einheiten unterstützt. Über seine lipoylierungsabhängige Aktivität trägt GCSH zum mitochondrialen, folatvermittelten Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel bei und beeinflusst dadurch die Nukleotidbiosynthese, das Redoxgleichgewicht und die metabolische Kopplung an die Serin–Glycin-Interkonversion. Eine genetische Störung von GCSH oder eine beeinträchtigte Lipoylierung ist mit Defekten im Glycinspaltungsweg verknüpft und wurde mit angeborenen Stoffwechselstörungen wie der nichtketotischen Hyperglyzinämie in Zusammenhang gebracht. Genome Editing von GCSH ermöglicht mechanistische Untersuchungen des mitochondrialen Aminosäurestoffwechsels, der Proteinlipoylierung und des Ein-Kohlenstoff-Flusses, einschließlich der Erzeugung zellulärer Modelle zur Analyse von metabolischen Stressantworten und der Funktion von Varianten.

GCSH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GCSH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCSH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GCSH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GCSH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCSH-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GCSH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCSH-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCSH-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GCSH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.