GCET2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418185-ACT

GCSAM (auch als GCET2 bekannt) ist ein lymphozytenassoziiertes Adapterprotein, das in Keimzentrums‑B‑Zellen und anderen hämatopoetischen Zelllinien angereichert ist und dort Signaloutputs unterstützt, die mit der Aktivierung des B‑Zell‑Rezeptors und dem Umbau des Zytoskeletts verknüpft sind. Indem GCET2 rezeptornahe Signale mit der Aktindynamik und dem Migrationsverhalten koppelt, wird es mit der Regulation von Aktivierung, Adhäsion und Zellverkehr von Immunzellen in lymphoiden Mikroumgebungen in Verbindung gebracht. Veränderte Expressionsmuster wurden in Kontexten von B‑Zell‑Malignomen beschrieben, was das Gen zu einem nützlichen Marker und mechanistischen Knotenpunkt für die Untersuchung von Signalwegen macht, die die Keimzentrumsbiologie und maligne Transformation prägen. Eine funktionelle Untersuchung von GCSAM hilft dabei, transkriptionelle Zustände mit Veränderungen in Signalamplitude, Zellmotilität und Interaktionen mit der Immunmikroumgebung zu verknüpfen.

GCET2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GCSAM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCET2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GCSAM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GCSAM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCET2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GCSAM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCET2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCET2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GCSAM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.