Plásmido CRISPR de Activación (m) GAP1^m: sc-431130-ACT

Rasa2 codifica en el ratón la proteína activadora de la actividad GTPasa de Ras, GAP1m, un regulador negativo de la señalización de Ras que acelera la hidrólisis de GTP para restringir la actividad de Ras. Al limitar la salida de las vías RAF–MEK–ERK y PI3K–AKT, GAP1m influye en la proliferación, la diferenciación y la dinámica del citoesqueleto en diversos tipos celulares. La expresión o la función alteradas de Rasa2 pueden desplazar los umbrales de señalización que controlan la respuesta a factores de crecimiento y la adaptación al estrés, lo que la hace relevante para estudios sobre la desregulación oncogénica de la vía de Ras y fenotipos del desarrollo. En contextos inmunitarios y estromales, la modulación de la atenuación de Ras por Rasa2 también se asocia con cambios en el estado de activación y la homeostasis tisular.

GAP1m El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Rasa2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GAP1m El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Rasa2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Rasa2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GAP1m. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Rasa2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GAP1m en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GAP1m en células tumorales con expresión de Rasa2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.