GAK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404235-ACT

Humanes GAK (cyclin-G-assoziierte Kinase) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die die clathrinvermittelte Endozytose koordiniert, indem sie die Dynamik des AP2-Adaptors und des Clathrin-Coats reguliert und dadurch die Internalisierung und den Transport von Rezeptoren beeinflusst. Durch die Kontrolle des Uncoatings von Vesikeln und der endosomalen Sortierung wirkt GAK auf Signaloutputs von Membranrezeptoren ein und trägt zur Aufrechterhaltung der zellulären Proteostase und Membranhomöostase bei. Seine Aktivität ist mit zellzyklusgekoppelten regulatorischen Netzwerken und stressresponsiven Signalwegen verknüpft, die auf einen effizienten vesikulären Transport angewiesen sind. Eine veränderte GAK-Expression oder -Funktion wurde in der Literatur mit für Neurodegeneration und Onkologie relevanten Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt zur Untersuchung von Pathway-Remodeling in Krankheitskontexten unterstützt.

GAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GAK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GAK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GAK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GAK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GAK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GAK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GAK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GAK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.