Plasmide CRISPR d'Activation (h) GAD-67: sc-400588-ACT

GAD1 code la glutamate décarboxylase 67 (GAD‑67), une enzyme dépendante du phosphate de pyridoxal qui catalyse la conversion du L‑glutamate en acide γ‑aminobutyrique (GABA), soutenant la neurotransmission inhibitrice et l’équilibre excitation–inhibition dans le système nerveux central humain. GAD‑67 contribue aux réserves cytosoliques de GABA dans les interneurones GABAergiques et est liée à la fonction synaptique, aux oscillations des réseaux neuronaux et au couplage métabolique dépendant de l’activité. Des modifications de l’expression de GAD1/GAD‑67 ont été associées à une perturbation de la signalisation GABAergique observée dans plusieurs affections neuropsychiatriques et neurodéveloppementales, ce qui en fait une cible majeure pour les études mécanistiques. La modulation expérimentale de GAD1 est couramment utilisée pour explorer la physiologie des circuits inhibiteurs, l’homéostasie des neurotransmetteurs et la régulation transcriptionnelle dans des modèles neuronaux.

GAD-67 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GAD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GAD-67 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GAD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GAD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GAD-67. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GAD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GAD-67 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GAD-67 dans les cellules tumorales présentant une expression de GAD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.