GAD-67 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400588-ACT

GAD1 codifica la decarbossilasi del glutammato 67 (GAD-67), un enzima dipendente dal fosfato di piridossale che catalizza la conversione dell’L-glutammato in acido γ-aminobutirrico (GABA), sostenendo la neurotrasmissione inibitoria e l’equilibrio eccitazione–inibizione nel sistema nervoso centrale umano. GAD-67 contribuisce ai pool citosolici di GABA negli interneuroni GABAergici ed è collegata alla funzione sinaptica, alle oscillazioni delle reti neuronali e all’accoppiamento metabolico dipendente dall’attività. Un’alterata espressione di GAD1/GAD-67 è stata associata all’alterazione della segnalazione GABAergica osservata in molteplici condizioni neuropsichiatriche e neurosviluppo, rendendola un bersaglio chiave per studi meccanicistici. La modulazione sperimentale di GAD1 è comunemente utilizzata per indagare la fisiologia dei circuiti inibitori, l’omeostasi dei neurotrasmettitori e la regolazione trascrizionale in modelli neuronali.

GAD-67 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GAD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GAD-67 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GAD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GAD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GAD-67. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GAD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GAD-67 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GAD-67 nelle cellule tumorali con espressione di GAD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.