GABA_A Rε CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405545-ACT

GABRE kodiert die ε‑Untereinheit des menschlichen GABA\_A‑Rezeptors, eines ligandengesteuerten Chloridkanals, der die schnelle inhibitorische Neurotransmission im zentralen Nervensystem vermittelt. Der Einbau der ε‑Untereinheit kann das Gating, die Pharmakologie und die Desensibilisierungskinetik des Rezeptors verändern und so die neuronale Erregbarkeit und die synaptische Inhibition prägen. Die Signalübertragung über den GABA\_A‑Rezeptor ist ein zentraler Bestandteil von Signalwegen ligandengesteuerter Ionenkanäle, die das Membranpotenzial, Netzwerkoszillationen und aktivitätsabhängige Plastizität regulieren. Eine dysregulierte GABAerge Tonuslage und eine veränderte Zusammensetzung der Rezeptoruntereinheiten wurden mit neuropsychiatrischen sowie anfallsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was mechanistische Studien zur untereinheitsspezifischen Funktion motiviert.

GABAA Rε Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GABRE-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GABAA Rε Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GABRE-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GABRE-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GABAA Rε-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GABRE-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GABAA Rε-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GABAA Rε-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GABRE-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.