Plásmido CRISPR de Activación (m) G530011O06Rik: sc-437289-ACT

El gen murino G530011O06Rik codifica la proteína G530011O06Rik, un factor escasamente caracterizado y con anotación funcional limitada en las bases de datos actuales de vías. La evidencia disponible sugiere que podría participar en procesos celulares fundamentales como la regulación transcripcional, el metabolismo del ARN u otros programas reguladores dependientes del contexto, lo que lo hace relevante para estudios a nivel de sistemas sobre la arquitectura de redes génicas. Dado que los genes de la colección de ADNc de RIKEN a menudo representan transcritos sensibles al linaje o al estímulo, la modulación de la expresión de G530011O06Rik puede ayudar a aclarar transiciones de estado celular, respuestas al estrés y programas de desarrollo. Definir su función endógena puede aportar información para la investigación mecanística en modelos relevantes de enfermedad en los que la desregulación de la expresión génica contribuye a fenotipos patológicos, sin implicar utilidad clínica.

G530011O06Rik El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de G530011O06Rik sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

G530011O06Rik El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus G530011O06Rik en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional G530011O06Rik, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de G530011O06Rik. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo G530011O06Rik y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de G530011O06Rik en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía G530011O06Rik en células tumorales con expresión de G530011O06Rik silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.