Plasmide CRISPR d'Activation (m) G530011O06Rik: sc-437289-ACT

Le gène murin G530011O06Rik code la protéine G530011O06Rik, un facteur encore mal caractérisé et pour lequel les bases de données actuelles de voies biologiques fournissent peu d’annotations fonctionnelles. Les données disponibles suggèrent qu’il pourrait intervenir dans des processus cellulaires fondamentaux tels que la régulation transcriptionnelle, le métabolisme des ARN ou d’autres programmes régulateurs dépendants du contexte, ce qui le rend pertinent pour des études à l’échelle des systèmes sur l’architecture des réseaux géniques. Comme les gènes de la collection d’ADNc RIKEN correspondent souvent à des transcrits spécifiques d’une lignée cellulaire ou induits par des stimuli, la modulation de l’expression de G530011O06Rik peut aider à clarifier les transitions d’état cellulaire, les réponses au stress et les programmes de développement. La définition de son rôle endogène peut éclairer des recherches mécanistiques dans des modèles pertinents pour des maladies où une dérégulation de l’expression génique contribue à des phénotypes pathologiques, sans pour autant suggérer une utilité clinique.

G530011O06Rik Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de G530011O06Rik sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

G530011O06Rik Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus G530011O06Rik dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription G530011O06Rik, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de G530011O06Rik. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus G530011O06Rik natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de G530011O06Rik au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie G530011O06Rik dans les cellules tumorales présentant une expression de G530011O06Rik silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.