G2E3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405720-ACT

Humanes G2E3 kodiert eine RING-Typ-E3-Ubiquitin-Protein-Ligase, die an der ubiquitinabhängigen Proteostase und der stressresponsiven Kontrolle des Zellzyklus beteiligt ist. Durch die Förderung einer selektiven Ubiquitinierung regulatorischer Proteine ist G2E3 in der Lage, DNA-Schadenssignalwege, den Fortschritt von Checkpoints sowie apoptosebezogene Prozesse zu beeinflussen, die das zelluläre Überleben unter genotoxischem oder Replikationsstress bestimmen. Eine veränderte Regulation von Ubiquitin-Ligase-Netzwerken, zu denen auch G2E3 gehört, wurde mit Phänotypen genomischer Instabilität und dysregulierten Proliferationsprogrammen in verschiedenen krankheitsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht. Daher wird G2E3 häufig im Hinblick auf seinen Beitrag zum Crosstalk zwischen Ubiquitin-Signalisierung, Zellzyklusdynamik und transkriptionellen Antworten auf zellulären Stress untersucht.

G2E3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen G2E3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

G2E3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des G2E3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der G2E3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen G2E3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native G2E3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von G2E3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des G2E3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem G2E3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.