G-CSF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400936-ACT

CSF3 kodiert den humanen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), ein sezerniertes Zytokin, das die Festlegung der neutrophilen Zelllinie, die Proliferation sowie die Mobilisierung aus dem Knochenmark reguliert. G-CSF signalisiert über CSF3R und aktiviert dabei die JAK/STAT-, MAPK/ERK- und PI3K/AKT-Signalwege, wodurch Granulopoese, die angeborene Immunbereitschaft und entzündliche Antworten geprägt werden. Eine fehlregulierte CSF3–CSF3R-Signalgebung wird mit veränderter Neutrophilen-Dynamik und verändertem Verhalten myeloider Zellen in entzündlichen Erkrankungen sowie im Kontext hämatologischer Malignome in Verbindung gebracht. Als gut manipulierbare Zytokinachse wird CSF3 häufig genutzt, um zytokingetriebene Transkriptionsprogramme und Zustände der myeloiden Differenzierung zu untersuchen.

G-CSF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CSF3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

G-CSF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CSF3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CSF3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen G-CSF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CSF3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von G-CSF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des G-CSF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CSF3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.