FLJ35220 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409086-ACT

ENDOV (FLJ35220) kodiert eine humane Endoribonuklease, die mit dem RNA-Stoffwechsel in Verbindung gebracht wurde und Berichten zufolge eine Präferenz für inosinhaltige RNA-Substrate aufweist, die durch A‑zu‑I‑RNA-Editing entstehen. Durch die Erkennung und Spaltung editierter oder strukturierter RNAs ist ENDOV in der Lage, die Stabilität von Transkripten und die RNA-Qualitätskontrolle zu beeinflussen und dabei mit breiteren posttranskriptionellen Regulationsnetzwerken zu interagieren, die Genexpressionsprogramme formen. Eine Fehlregulation der RNA-Prozessierung sowie editing-assoziierter Signalwege ist mit veränderten zellulären Stressantworten und Immun-Signalkaskaden assoziiert, wodurch ENDOV einen relevanten Ansatzpunkt für mechanistische Studien darstellt, die RNA-Überwachung mit krankheitsassoziierten transkriptomischen Veränderungen verknüpfen.

EndoV Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ENDOV-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EndoV Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ENDOV-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ENDOV-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EndoV-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ENDOV-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EndoV-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EndoV-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ENDOV-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.