FKHRL1/FOXO3a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400308-ACT

FOXO3 (FKHRL1/FOXO3a) è un fattore di trascrizione della famiglia forkhead box che integra la segnalazione insulina/IGF-1–PI3K–AKT con le risposte cellulari allo stress per regolare geni che controllano l’apoptosi, l’arresto del ciclo cellulare, la riparazione dei danni al DNA, l’autofagia e le difese antiossidanti. La fosforilazione mediata da AKT promuove l’esclusione nucleare di FOXO3, mentre lo stress ossidativo e segnali dipendenti da AMPK ne favoriscono l’attività nucleare e programmi trascrizionali legati all’omeostasi metabolica e alla sopravvivenza. FOXO3 interagisce anche con le vie di segnalazione TGF-β, MAPK e mTOR, contribuendo a modellare la differenziazione e le risposte immunitarie e infiammatorie nei diversi tipi cellulari. Un’alterata regolazione di FOXO3 è stata associata alla biologia tumorale, a processi neurodegenerativi, a fenotipi cardiometabolici e a caratteristiche legate all’invecchiamento, rendendolo un nodo comune negli studi meccanicistici dell’adattamento allo stress.

FKHRL1/FOXO3a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXO3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FKHRL1/FOXO3a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXO3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXO3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FKHRL1/FOXO3a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXO3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FKHRL1/FOXO3a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FKHRL1/FOXO3a nelle cellule tumorali con espressione di FOXO3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.