Plásmido CRISPR de Activación (h) FKHRL1/FOXO3a: sc-400308-ACT

FOXO3 (FKHRL1/FOXO3a) es un factor de transcripción de la familia forkhead box que integra la señalización de insulina/IGF-1–PI3K–AKT con las respuestas celulares al estrés para regular genes que controlan la apoptosis, la detención del ciclo celular, la reparación del daño en el ADN, la autofagia y la defensa antioxidante. La fosforilación por AKT promueve la exclusión nuclear de FOXO3, mientras que el estrés oxidativo y las señales dependientes de AMPK favorecen su actividad nuclear y programas transcripcionales vinculados a la homeostasis metabólica y la supervivencia. FOXO3 también interactúa con las vías de TGF-β, MAPK y mTOR para modular la diferenciación y las respuestas inmunitarias e inflamatorias en distintos tipos celulares. La regulación alterada de FOXO3 se ha asociado con la biología tumoral, procesos neurodegenerativos, fenotipos cardiometabólicos y rasgos relacionados con el envejecimiento, lo que lo convierte en un nodo común para estudios mecanísticos de adaptación al estrés.

FKHRL1/FOXO3a El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FOXO3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FKHRL1/FOXO3a El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FOXO3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FOXO3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FKHRL1/FOXO3a. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FOXO3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FKHRL1/FOXO3a en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FKHRL1/FOXO3a en células tumorales con expresión de FOXO3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.