Fibulin-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-432105-ACT

Efemp1 codifica a fibulina-3, uma glicoproteína da matriz extracelular que se integra em microfibrilas associadas a fibras elásticas e modula a montagem e a estabilidade da matriz. Em tecidos de camundongo, a fibulina-3 influencia a adesão célula–matriz, a migração e o remodelamento tecidual ao moldar a organização da matriz extracelular e a atividade de proteases, com efeitos a jusante em vias ligadas à fibrose, à angiogênese e à sinalização inflamatória. Níveis alterados de fibulina-3 têm sido associados a fenótipos do tecido conjuntivo e da retina e são frequentemente estudados no contexto de desregulação da matriz, incluindo o remodelamento do microambiente tumoral e processos degenerativos relacionados ao envelhecimento. Assim, Efemp1 constitui um locus adequado para investigar como a composição da matriz extracelular controla a mecanobiologia e programas de resposta ao estresse.

Fibulin-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Efemp1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Fibulin-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Efemp1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Efemp1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Fibulin-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Efemp1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Fibulin-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Fibulin-3 em células tumorais com expressão de Efemp1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.