Plasmide CRISPR d'Activation (h) FBL3B: sc-405317-ACT

FBXL21 code une protéine à boîte F et à répétitions riches en leucine, qui agit comme composant de reconnaissance des substrats au sein d’un complexe ligase E3 ubiquitine SCF (SKP1–CUL1–F-box), orientant des cibles spécifiques vers l’ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Par une dégradation protéique finement régulée, FBXL21 contribue au contrôle de la temporalité cellulaire, des réponses au stress et de la protéostasie, avec une pertinence particulière pour les réseaux de régulation circadiens et transcriptionnels. En modulant la stabilité des effecteurs de voies de signalisation, FBXL21 peut influencer la dynamique du signal, la coordination du cycle cellulaire et l’adaptation aux signaux environnementaux. Le dérèglement des composants du système ubiquitine–protéasome, y compris des protéines à boîte F, est largement associé à la signalisation oncogénique, à la neurobiologie et à des phénotypes inflammatoires, faisant de FBXL21/FBL3B un nœud utile pour des investigations mécanistiques.

FBL3B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FBXL21 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FBL3B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FBXL21 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FBXL21, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FBL3B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FBXL21 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FBL3B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FBL3B dans les cellules tumorales présentant une expression de FBXL21 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.