Plásmido CRISPR de Activación (h) FANCA: sc-403205-ACT

FANCA codifica un componente central de la vía de reparación del ADN de la anemia de Fanconi (FA), que coordina la reparación de los enlaces cruzados interhebra del ADN y estabiliza las horquillas de replicación durante la fase S. FANCA participa en el complejo central de la FA, que promueve la monoubiquitinación de FANCD2 y FANCI, permitiendo el procesamiento nucleolítico posterior y la reparación asociada a la recombinación homóloga. La alteración de FANCA compromete la integridad del genoma, incrementa la rotura cromosómica y sensibiliza a las células al daño por agentes entrecruzantes, vinculando este gen con la patología molecular de la anemia de Fanconi y con mecanismos más amplios de estrés replicativo. Como resultado, FANCA se estudia ampliamente en rutas que regulan la señalización de daño en el ADN, los puntos de control del ciclo celular y el mantenimiento de la estabilidad cromosómica.

FANCA El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de FANCA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FANCA El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus FANCA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional FANCA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FANCA. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo FANCA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FANCA en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FANCA en células tumorales con expresión de FANCA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.