Plásmido CRISPR de Activación (m) FAK: sc-420280-ACT

La proteína tirosina quinasa 2 (Ptk2) codifica la quinasa de adhesión focal (FAK), una tirosina quinasa no receptora que integra señales de las integrinas y de los receptores de factores de crecimiento para coordinar el recambio de las adhesiones focales y la remodelación del citoesqueleto de actina. En células de ratón, FAK regula la adhesión celular, la migración, la polaridad y la supervivencia mediante vías que incluyen PI3K–AKT, MAPK/ERK, la señalización de GTPasas de la familia Rho y cascadas de fosforilación dependientes de SRC. FAK también interactúa con programas de mecanotransducción que acoplan la rigidez de la matriz extracelular a respuestas transcripcionales y a la contractilidad celular. La señalización desregulada de FAK se asocia con un remodelado tisular alterado, microambientes inflamatorios y fenotipos invasivos, lo que convierte a Ptk2 en un nodo ampliamente estudiado en modelos de progresión tumoral, fibrosis y biología vascular.

FAK El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ptk2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

FAK El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ptk2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ptk2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de FAK. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ptk2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de FAK en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía FAK en células tumorales con expresión de Ptk2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.