Evi-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404112-ACT

MECOM kodiert den Transkriptionsfaktor Evi-1, ein Zinkfingerprotein, das an regulatorische DNA-Elemente bindet und so die Festlegung von Zelllinien (Lineage Specification), Selbsterneuerung und Differenzierungsprogramme steuert. Evi-1 beeinflusst den Chromatinzustand und transkriptionelle Netzwerke, die an Hämatopoese und Entwicklungsmusterbildung beteiligt sind, mit nachgelagerten Effekten auf Proliferation und Apoptose. Eine fehlregulierte MECOM/Evi-1-Aktivität wird mit aberranter transkriptioneller Kontrolle in der Krebsbiologie in Verbindung gebracht, insbesondere bei hämatologischen Malignomen, und ist zudem an breiteren Entwicklungs- und Zellschicksalsphänotypen beteiligt. Diese Eigenschaften machen MECOM zu einem relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung transkriptioneller Schaltkreise, epigenetischer Regulation und des Umbaus onkogener Signalwege in menschlichen Zellen.

Evi-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MECOM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Evi-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MECOM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MECOM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Evi-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MECOM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Evi-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Evi-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MECOM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.