Evi-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404112-ACT

O MECOM codifica o fator de transcrição Evi-1, uma proteína com dedos de zinco que se liga a elementos regulatórios do DNA para controlar programas de especificação de linhagem, autorrenovação e diferenciação. O Evi-1 influencia o estado da cromatina e redes transcricionais envolvidas na hematopoiese e no padrão de desenvolvimento, com efeitos a jusante sobre proliferação e apoptose. A atividade desregulada de MECOM/Evi-1 está associada a um controle transcricional aberrante na biologia do câncer, particularmente em neoplasias hematológicas, e também está implicada em fenótipos mais amplos de desenvolvimento e determinação do destino celular. Essas propriedades tornam o MECOM um nó relevante para estudar circuitos transcricionais, regulação epigenética e remodelamento de vias oncogênicas em células humanas.

Evi-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MECOM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Evi-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MECOM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MECOM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Evi-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MECOM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Evi-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Evi-1 em células tumorais com expressão de MECOM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.