ephrin-A5 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420123-ACT

Efna5 kodiert Ephrin-A5, einen über einen Glycosylphosphatidylinositol-(GPI)-Anker membranverankerten Liganden für EphA-Rezeptoren, der kontaktabhängige Zellsignale vermittelt und so Axonführung, neuronale Migration und synaptische Organisation steuert. Vorwärts- und Rückwärtssignalisierung durch Ephrin-A5–Eph koordiniert über GTPasen der Rho-Familie den Umbau des Zytoskeletts und greift in MAPK/ERK- sowie PI3K-assoziierte Signalwege ein, um Adhäsion, Repulsion und die Bildung von Gewebegrenzen zu regulieren. In Mausmodellen wird die Efna5-Aktivität häufig genutzt, um Mechanismen der Assemblierung neuronaler Schaltkreise, des retinalen Mappings und der Entwicklungsmusterbildung zu untersuchen. Eine Fehlregulation der Ephrin/Eph-Signalisierung wird mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen sowie aberranten Programmen der Zellmotilität in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und die Angiogeneseforschung relevant sind.

ephrin-A5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Efna5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ephrin-A5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Efna5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Efna5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ephrin-A5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Efna5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ephrin-A5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ephrin-A5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Efna5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.