Plásmido CRISPR de Activación (h) ephrin-A2: sc-403672-ACT

EFNA2 codifica la efrina-A2, un ligando de membrana anclado por glicosilfosfatidilinositol (GPI) para las tirosina quinasas receptoras Eph, que media la señalización dependiente de contacto en la comunicación célula–célula. La señalización Eph/efrina regula la guía axonal, el ensamblaje de circuitos neuronales, el patrón vascular, la formación de límites epiteliales y la migración celular mediante vías que se interconectan con las GTPasas de la familia Rho, la señalización MAPK y la remodelación del citoesqueleto. La expresión alterada de EFNA2 o el desequilibrio en la señalización EphA–efrina-A se ha asociado con fenotipos de adhesión y motilidad desregulados, relevantes para procesos del neurodesarrollo y la biología del cáncer, incluida la invasión tumoral y la remodelación angiogénica. Como señal anclada a la superficie, la efrina-A2 también es útil para estudiar la señalización bidireccional, en la que las células que expresan el ligando y las que expresan el receptor desencadenan respuestas posteriores distintas.

ephrin-A2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EFNA2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ephrin-A2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EFNA2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EFNA2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ephrin-A2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EFNA2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ephrin-A2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ephrin-A2 en células tumorales con expresión de EFNA2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.