Plasmide CRISPR d'Activation (h) ephrin-A1: sc-401309-ACT

EFNA1 code l’éphrine-A1, un ligand de surface cellulaire ancré par GPI des récepteurs tyrosine kinases EphA, qui assure une signalisation dépendante du contact afin de réguler le positionnement cellulaire, la formation de frontières et la morphogenèse tissulaire. Les interactions éphrine-A1/EphA coordonnent une signalisation bidirectionnelle qui influence les GTPases de la famille Rho, la dynamique du cytosquelette, le renouvellement des adhésions et la migration, avec des effets en aval sur l’activité des voies MAPK et PI3K/AKT selon le contexte cellulaire. Dans les cellules humaines, EFNA1 est impliqué dans le remodelage angiogénique, l’organisation épithéliale et le dialogue avec le microenvironnement inflammatoire. Une dérégulation de la signalisation de l’éphrine-A1 a été associée à des comportements vasculaires altérés et à des phénotypes invasifs en oncologie, ce qui en fait un nœud utile pour l’étude des réseaux de signalisation récepteur–ligand et de la motilité cellulaire dépendante du microenvironnement.

ephrin-A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EFNA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ephrin-A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EFNA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EFNA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ephrin-A1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EFNA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ephrin-A1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ephrin-A1 dans les cellules tumorales présentant une expression de EFNA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.