EN2/Engrailed 2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403598-ACT

EN2 (Engrailed 2) codifica um fator de transcrição do tipo homeobox que regula programas de expressão gênica que controlam o neurodesenvolvimento, o padrão regional e a diferenciação neuronal. O EN2 influencia o estado da cromatina e redes transcricionais envolvidas na orientação axonal, na organização sináptica e na maturação de estruturas do mesencéfalo–rombencéfalo, integrando-se a vias de desenvolvimento como a sinalização WNT/β-catenina, SHH e FGF. A expressão desregulada de EN2 tem sido associada a alterações na formação de circuitos neurais e vem sendo investigada no contexto de fenótipos do neurodesenvolvimento e da biologia de tumores cerebrais. Como regulador ligado à linhagem e à diferenciação, o EN2 serve como um nó útil para estudar o controle transcricional da identidade neural, as transições de estado celular e redes de genes-alvo a jusante em sistemas modelo humanos.

EN2/Engrailed 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EN2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EN2/Engrailed 2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EN2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EN2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EN2/Engrailed 2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EN2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EN2/Engrailed 2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EN2/Engrailed 2 em células tumorais com expressão de EN2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.