EHHADH CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404068-ACT

EHHADH (Enoyl-CoA-Hydratase und 3‑Hydroxyacyl‑CoA‑Dehydrogenase) kodiert ein bifunktionelles peroxisomales Enzym, das aufeinanderfolgende Schritte der peroxisomalen Fettsäure‑β‑Oxidation katalysiert und so die Kettenverkürzung sehr langkettiger sowie verzweigtkettiger Fettsäure‑Acyl‑CoAs unterstützt. Über seine Rolle im Lipidkatabolismus und in der Redoxbalance trägt EHHADH zur metabolischen Kommunikation zwischen Peroxisomen und Mitochondrien sowie zur Regulation der zellulären Energiehomöostase bei. Eine veränderte EHHADH‑Expression oder ‑Aktivität wurde mit Phänotypen peroxisomaler Dysfunktion und mit für Stoffwechselerkrankungen relevanten Prozessen in Verbindung gebracht, darunter Lipidakkumulation, oxidativer Stress und die metabolische Anpassung der Leber. EHHADH ist daher ein nützliches Ziel zur Untersuchung der peroxisomengetriebenen Lipidmetabolisierung, der Organellenhomöostase und von Transkriptionsprogrammen, die mit metabolischem Stress verknüpft sind.

EHHADH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EHHADH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EHHADH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EHHADH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EHHADH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EHHADH-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EHHADH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EHHADH-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EHHADH-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EHHADH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.