Plásmido CRISPR de Activación (h2) EHD3: sc-404685-ACT-2

La EHD3 humana (proteína 3 con dominio EH) es una ATPasa de la familia EHD que regula el reciclaje endocítico y la tubulación de membranas, coordinando el tráfico desde los endosomas tempranos hacia los endosomas de reciclaje y de vuelta a la membrana plasmática. Al interactuar con efectores de Rab y socios asociados a membrana, EHD3 influye en la internalización y el reciclaje de receptores, la escisión de vesículas y la organización espacial de plataformas de señalización que modelan la polaridad celular y la migración. La alteración de la expresión de EHD3 se ha relacionado con programas desregulados de transporte endosomal observados en la biología del cáncer y en contextos neurológicos en los que el reciclaje de membrana afecta la función sináptica y la homeostasis celular. La edición genética de EHD3 en modelos de células humanas permite estudios mecanísticos del tráfico de endosoma a membrana, de las decisiones sobre el destino de los receptores y de las consecuencias posteriores en la señalización mediante imágenes, proteómica y ensayos funcionales de la dinámica vesicular.

EHD3 El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EHD3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

EHD3 El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EHD3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EHD3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de EHD3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EHD3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de EHD3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía EHD3 en células tumorales con expresión de EHD3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.